新型lncRNA MANTIS通过表观遗传调控促进内皮细胞血管生成
背景：
新型lncRNA MANTIS通过表观遗传调控促进内皮细胞血管生成长链非编码RNA （lncRNA）可在表观遗传水平、转录水平和转录后水平调控编码基因的表达，从而控制不同的生物过程。目前对lncRNA在表观遗传水平上的调控机制了解甚少。内皮细胞的血管生成功能受到许多机制的调控，但长链非编码RNA（lncRNA）对血管内皮细胞的影响几乎没有被研究。研究人员着手鉴定新型和功能重要的内皮细胞lncRNAs。
研究思路：
结果：
1、筛选和鉴定内皮血管生成相关lncRNA通过RNAi技术敲减JARID1B基因，外显子芯片检测（A）和qPCR验证发现n342419下调最为明显，并命名为MANTIS。序列鉴定和非编码特性验证后，qPCR在特发性肺动脉高压病人和健康人肺(B), 猕猴血管(C) 和胶质母细胞瘤细胞vs邻近健康脑内皮细胞（D）中研究MANTIS的表达特性，原位杂交验证其表达特征（E）。 利用CRIPSR/Cas9敲除 lncRNA MANTIS，确定它影响血管细胞生成（G-N）。
2、lncRNA MANTIS与染色质复合物亚基BRG1相互作用确定MANTIS的血管调控功能后，接下来研究MANTIS的表观调控机制。细胞定位决定基因的功能执行方向，因此利用FISH确定MANTIS定位于细胞核（A），确定它可能在表观水平上发挥作用。利用细胞核RNA pull down 和质谱筛选与它结合的染色质蛋白BRG1，且BRG1与内皮血管相关（B-E），RNA免疫沉淀验证MANTIS与蛋白BRG1结合的特异性（F、G）。
3、lncRNA MANTIS下游靶基因鉴定
LNA-GapmeR敲减MANTIS：通过Illumina Bead-Chip Array筛选MANTIS调控的下游基因（A）；qPCR验证邻近基因表达无变化，排除顺式调控活性（B）, qPCR和WB验证血管调控基因SOX18、SMAD6和 COUP-TFII在MANTIS敲减后表达下调（C-I）；并在特发性血管高压病人中验证下游基因的低表达（J-K）。说明lncRNA MANTIS调控基因SOX18、SMAD6和 COUP-TFII的表达。
4、敲减SMAD6、 COUP-TFII和SOX18基因可模拟lncRNA MANTIS缺失表型
SiRNA敲除lnc MANTIS和靶基因（A）, 均减少内皮细胞发芽、数量和生长（B-D）。MANTIS 外显子3上有Alu元件，可能具有重要作用，该元件突变后，可部分恢复内皮细胞发芽能力（E-H）。大鼠模型上对应的同源基因和SMAD6、 COUP-TFII和SOX18也具有类似表达特性（I）。说明IPAH的保守性及通过SMAD6、 COUP-TFII和SOX18参与血管生成。
5、MANTIS与BRAG1结合影响核小体的重塑为研究MANTIS与BRAG1结合是否影响核小体重塑活性，作者敲除MANTIS，WB检测发现BRG1蛋白水平无变化（A）,转座酶无障碍染色质测序（ATAC-Seq）检测发现靶基因转录起始附近open chromatin 的Reads数减少（B）, FAIRE（C）和Mnase(D)进一步验证调控区域。
6、MANTIS通过稳定BRG1和BAF155之间的相互作用，对染色质复合物SWI/SNF的ATPase功能起重要作用BRG1的重塑活性受BAF155刺激，为研究MANTIS对染色质复合物的影响，利用邻位连接技术（PLA）研究MANTIS对 BRG1与BAF155和BAF53A的结合作用的影响（A、B）。并通过过表达不同长度MANTIS突变体，发现MANTIS影响BRG1和BAF155相互结合作用，但不影响它们蛋白水平（C-F）。
7、MANTIS 调控机制图
案例点评：
本研究首先确定关键lncRNA与内皮血管的关系，接着探究lncRNA对靶基因的调控机制。其方案设计思路清晰，研究目的明确，操作性合理，结合目前研究基础引入多个创新点，具有一定的临床研究的价值。
